Magyar Tudomány, 2004/10 1080. o.

Védekezési mechanizmusok az élővilágban

Andó István

tudományos tanácsadó, a biológiai tudomány doktora

Ando @ nucleus.szbk.u-szeged.hu

Laurinyecz Barbara

PhD-hallgató

Márkus Róbert

PhD-hallgató

Rus Florentina

PhD-hallgató

Váczi Balázs

PhD-hallgató

Zsámboki János

szakdolgozó

Kurucz Éva

tudományos főmunkatárs, PhD

MTA Szegedi Biológiai Központ Genetikai Intézet

Ősi örökségünk, a veleszületett immunitás:

a Drosophila immunrendszere


A rovarok a fajok számát és változatosságát tekintve az élővilág legsikeresebb tagjai. Becslések szerint a jelenleg élő állatfajok mintegy 90 %-át alkotják, és mind a szárazföldön, mind a vizekben széleskörűen elterjedtek. Élőhelyüket potenciális ellenségeikkel, mikroorganizmusokkal és soksejtű parazitákkal osztják meg, melyekkel állandó küzdelemben állnak. A múlt század elején már nyilvánvalóvá vált, hogy a rovarok a kórokozókkal szemben hatékony, humorális és sejtes elemekből álló immunrendszerrel védekeznek. A humorális immunválasz a fertőzések által kiváltott antimikrobiális peptidek termelése, melynek genetikai szabályozása és folyamata jól ismert. Tudjuk, hogy a fertőzés a rovarok zsírtestjének sejtjeiben, a gerincesek májának funkcionális homológjában, és egyes vérsejtekben váltja ki az antimikrobiális peptidek termelését. Az antimikrobiális peptidek általában a bakteriális sejtmembránnak a szerveződés szempontjából egyik legkonzervatívabb elemeihez, az ioncsatornákhoz hasonló szerkezeteket hoznak létre: vagy rendszertelen beépülésükkel zilálják szét a membrán szerkezetét, vagy több molekula együtt, csatorna formájában komplexet alkot, átengedi az ionokat, és így teszi tönkre a mikroba ionháztartását. Az ioncsatornák szerkezetének nagyfokú konzerváltsága biztosítja a strukturális és működésbeni alapot a peptidek támadásához, ugyanakkor a peptidek membránba történő sikeres beépülése eredményezi a mikroorganizmus biztos pusztulását. Az ioncsatornák alapvető biológiai funkciójából származó konzerváltsága eredményezi azt, hogy a peptidekkel szemben az évek tízmilliói során sem alakult ki rezisztencia. Ez a humorális válasz nem rendelkezik a gerincesek immunellenanyagaihoz hasonló specifitással és memóriával, viszont szabályozásának egyes elemei szinte az egész élővilágban azonos szerepet töltenek be. Ezeknek a szerkezetileg egymáshoz hasonló elemeknek a közös őse nem ismert, azonban valószínű, hogy a saját-nem saját struktúrák egymástól történő megkülönböztetésében játszott szerepet. Ezeknek a molekuláknak az első megismert képviselője a Drosophila Toll receptor, amely napjainkban egy soktagú és egyre bővülő molekulacsalád alapítója. A sejtes immunválasz legősibb folyamata, a bekebelezés, az egysejtű szervezetektől a rovarokon keresztül a gerincesekig minden állati szervezetben a védekező reakciók részét képezi, és a sejtnél kisebb méretű részecskék eltávolítására hivatott. A sejtméretű vagy annál nagyobb részecskék eltávolítására a többsejtű szervezetekben speciális védekező reakciók (tokképzés, természetes ölő aktivitás) jöttek létre.

A Drosophila immunvédekezése

A Drosophila fejlődése minden egyes stádiumában más és más védelmi rendszert használ a szervezete egységének megbontására készülő betolakodókkal szemben. Az embriót a mikroorganizmusok számára áthatolhatatlan burok veszi körül. A lárvákat lágy kitinkutikula védi a mikroorganizmusok behatolásától, de egyes paraziták, például a fürkészdarazsak tojócsöve könnyedén áthatol rajta. A testnyílások - a száj, a végbélnyílás és a légzőnyílások - a mikroorganizmusok számára nyithatnak kaput. A kifejlett rovarok kemény kutikulája a fizikai ártalmakkal szemben biztosít hatékony védelmet, de a légzőnyílások és az emésztőcső nyílása a mikroorganizmusok számára ugyanúgy bemeneti kapuként szolgálhat, mint a lárvákban. Az immunvédekezés elemei is ennek megfelelően változnak az egyedfejlődés során. Az embrióban az úgynevezett embrionális falósejtek az apoptotikus sejtek eltávolítására specializálódtak, de az immunvédekezésben betöltött esetleges szerepük nem tisztázott. A lárvában jelennek meg először, és a kifejlett rovarban is jelen vannak a betolakodók eltávolítását szolgáló immunszövetek és immunvédekezési folyamatok. A tápanyaggal az emésztőcsőbe jutó mikroorganizmusokat a helyben termelődő lizozim enzim, a légzőnyílásokon behatoló baktériumokat és gombákat pedig a nyílásoknál elhelyezkedő hámsejtek által termelt antimikrobiális peptidek támadják meg. A testüregbe bejutott mikroorganizmusokat a testnedvekben keringő vérsejtek egy csoportja, a plazmatociták kebelezik be, valamint a zsírtest által termelt antimikrobiális peptidek pusztítják el. Az így elpusztított mikroorganizmusokat ugyancsak a vérsejtek takarítják el a szervezetből.

A lárvák számára jelentős veszélyt jelentenek a paraziták és a parazitoidok, köztük is a leggyakrabban előforduló fürkészdarazsak. Ez utóbbiak petéiket a Drosophila lárva testüregébe rakják, és a fejlődő parazitoidok számára a Drosophila szövetei szolgálnak táplálékul. A parazitoiddal történt fertőzést követően az esetek egy részében a Drosophila lárvája a paraziták "felnevelése" során elpusztul. Ha a parazitoiddal történő fertőzés minden esetben sikeres lenne, az előbb-utóbb a gazdaszervezet és ezzel együtt magának a parazitoidnak a kihalásához vezetne. Egy populációszinten finoman szabályozott immunreakció megléte vagy hiánya azonban biztosítja mind a gazdaszervezet, mind pedig a parazitoid túlélését: néhány esetben a gazdaszervezet hatékony immunreakciót indít a betolakodóval szemben, melynek során nagyméretű, lapos vérsejtek, a lamellociták differenciálódnak. A lamellociták több rétegben burkolják be a plazmatociták által nem bekebelezhető nagyméretű parazioid petéket, majd az így képződött tok a petével együtt melanizálódik, és a pete elpusztul. A melanizációs folyamatban kitüntetett szerepet játszanak a kristályszerű zárványokat, a feltételezések szerint profenoloxidázt tartalmazó vérsejtek, az ún. kristálysejtek. További veszélyforrást jelentenek a Drosophila számára a szövetburjánzások, tumorok. Ezek kifejlődése szinte minden esetben a szervezet pusztulásához vezet. Az immunrendszerben képződő szövetburjánzások és tumoros sejtek invázióját követően a vérsejtek száma emelkedik, melyet a legtöbb esetben lamellociták differenciálódása és tokképzés kísér.

A kifejlett rovarra nézve a legnagyobb veszélyt a mikroorganizmusok jelentik. Az emésztő- vagy a légzőszerven keresztül behatoló baktériumokat és gombákat - a lárvához hasonlóan - az antimikrobiális peptidek és a falósejtek távolítják el. Érdekes, hogy osztódó vérsejtek kizárólag az embrióban és a lárvában fordulnak elő. A kifejlett rovarban eddig nem sikerült osztódó vérsejteket azonosítani.

A Gram-pozitív baktériumok és a gombák, valamint a Gram-negatív baktériumok egymástól eltérő aktivációs utakon keresztül különböző antimikrobiális peptidek termelését indukálják. A humorális immunválasz szabályozásában szerepet játszó transzkripciós faktorok közvetlenül csak az antimikrobiális peptidek termelésének a szabályozásában vesznek részt, a celluláris immunválaszt nem érintik.

A humorális immunitás szabályozása

A mikrobák - gombák, Gr+ és Gr- baktériumok felismerése - egymástól eltérő genetikai finomszabályozás alatt áll. A Drosophila humorális immunválaszához vezető antimikrobiális peptid gének megnyilvánulását alapvetően két aktivációs út, a Toll és az Imd aktivációs utak elemei szabályozzák. A Toll közvetítette utat gombák és Gram-pozitív baktériumok aktiválják, különböző mechanizmus alapján: a gombák, egy eddig ismeretlen folyamat révén egy proteolitikus láncreakció eredményeként a Toll receptor endogén ligandját, a Spätzle-t aktiválják. A Gram-pozitív baktériumok egy ettől független, szekretált, szolubilis, peptidoglikán-felismerő proteinen keresztül aktiválják az immunválaszt. A Toll út aktiválása minden esetben a Dif transzkripciós faktor sejtmagba történő átjutását eredményezi, amit antimikrobiális peptidek (drosomicin) termelése követ. A Gram-negatív baktériumokat egy peptidoglikán-felismerő transzmembrán receptor ismeri fel, és ez vezet az Imd jelátviteli út Relish NF-êB transzkripciós faktoron keresztüli aktiválásához. Az Imd út nagyfokú hasonlóságot mutat az emlős TNF-á aktivációhoz.

A Toll receptorcsalád

Az legelsőként a Drosophilában azonosított, az embrió hát-hasi polaritás kialakulását szabályozó Toll receptor egy transzmembrán fehérje, leucingazdag extracelluláris, és az IL-1 receptor intracelluláris jelátvivő régiójához hasonló domént tartalmaz. A Toll receptornak a specifikus liganddal történő kapcsolódása egy olyan láncreakciót aktivál, melynek eredményeként a citoplazmában lévő transzkripciós faktorok előalakjai proteolízis eredményeként aktiválódnak, a sejtmagba vándorolnak, és ott a Gram-pozitív baktériumokat és gombákat elpusztító antimikrobiális peptideket kódoló gének aktiválódását indítják meg. Bár a Drosophilában azonosított Toll receptorok száma jelenleg tíz körül jár, semmilyen jel nem utal arra, hogy a különböző Toll molekulák különböző mikroorganizmusokat ismernének fel. A Drosophila Toll nem köt mikrobiális komponenseket, sőt, mikrobákkal történő fertőzést követően a kifejeződésük szintje sem változik. A humán genom program előrehaladtával kiderült, hogy a humán genomban igen sok Toll receptor kódolt, melyek az immunrendszer egyes elemein nyilvánulnak meg. A Drosophilával ellentétben, az emlős Toll receptorok mikrobiális komponenseket is felismernek, és a Toll-receptorok közvetítette sejtaktiválás eredője a kialakuló elsődleges immunválasz. A Drosophila és a gerinces Toll szekvenciáinak összehasonlítása azt mutatja, hogy a rovarok és az emlősök közös őse valószínűleg egyetlen Toll génnel rendelkezett, mely duplikálódott, és ezt követően, különböző szelekciós nyomáshoz alkalmazkodva két fő géncsaláddá fejlődött, melyeknek egyike endogén ingereket, míg másik csoportja a mikrobák antigénjeinek konzervált elemeit, mintázatát ismeri fel.

A peptidoglikán receptorok (PGRP-k)

A PGRP-ket először molylepkében, a melanizációs folyamatok szabályozójaként azonosították. Később felismerték az antimikrobiális peptidek termelésének szabályozásában, ezen belül a peptidoglikánok felismerésében betöltött szerepét, majd szekvenciahomológiák alapján Drosophilában is megtalálták. Drosophilában legalább tizenhárom, emberben legalább négy formája ismert; valamennyinek közös eleme a százhatvan aminosavas peptidoglikán-felismerő domén, valamint mindkét fajban létezik szekretált és transzmembrán receptor formája. Drosophilában a szekretált forma szükséges a Gr+, míg a transzmembrán forma a Gr- baktériumokkal szembeni immunválasz megindításához.

A Drosophila sejtes immunitása

Az antimikrobiális peptidek termelésének jól ismert szabályozási folyamatai mellett az immunválasznak olyan folyamatai is léteznek, melyeknek részleteiről keveset tudunk. Ezek közé tartozik a vérsejtek által közvetített sejtes immunitás két fő formája, a bekebelezés és a tokképző reakció. A sejtes immunválaszt eddig elsősorban morfológiai szempontból sikerült jellemezni, azaz fénymikroszkópos, elektronmikroszkópos, valamint klasszikus szövettani festési eljárásokkal sikerült azonosítani a fő vérsejtalakokat. Nagyon keveset tudunk azonban azokról a sejtekhez kapcsolt folyamatokról, melyek a támadó mikroorganizmusok és paraziták felismerését követően a mikroorganizmusok bekebelezéséhez vagy a parazitáknak a gazdaszervezetben történő elhatárolásához, betokozódásához vezetnek. A sejtes és a humorális immunválaszt megelőzően, illetve azzal egy időben proteolitikus kaszkádok aktiválódnak, melyek a testnedvek koagulációját, valamint melanizációs folyamatokat indítanak el, és végső soron a sérülés helyének gyógyulásához vezetnek, vagy a betolakodó pusztulását eredményezik. Nemcsak a sejtes immunitás alapvető folyamatairól szerzett ismereteink hiányosak, hanem a fő vérsejt osztályok fejlődéséről, egymáshoz való viszonyáról is igen keveset tudunk. Ezért határoztuk el, hogy a Drosophila mint modellszervezet által biztosított molekuláris biológiai és klasszikus genetikai eszköztárat ötvözzük az immunológia eszköztárával. Ennek eredményeként egy genomikai és proteom szintű megközelítésre épült rendszert hoztunk létre, mely a Drosophila veleszületett immunitásának megismerésén túlmenően a veleszületett immunitás eddig ismeretlen, az állatvilágra általánosan érvényes folyamatainak vizsgálatát teszi lehetővé.

Az immunrendszer sejtes elemeire jellemző molekuláris markereket azonosítunk, jellemezzük a kódoló géneket, és meghatározzuk a gének regulátor régióit. Így a vérsejt differenciálódási vonalak azonosítása mellett, a vizsgált gének sejttípus-specifikus kifejeződésének következtében, az adott sejttípus működését is megismerhetjük. Ennek a vizsgálati rendszernek a segítségével a Drosophila sejtes immunitásának kialakulásában és a sejtes immunválasz szabályozásában irányító szerepet játszó molekulákat azonosítunk. Eddigi ismereteink szerint a Drosophila és az ember utolsó közös ősének veleszületett immunitása szinte egy egységként maradt fenn az evolúció több százmillió éve alatt, ezért feltételezhetjük, hogy a sejtes immunitás molekuláris elemei is minimális változásokkal élték túl az evolúció viharait. Reményeink szerint az azonosított új elemek hidat képeznek az idő homályába vesző közös ősökön keresztül a törzsfejlődés során egymástól távol került fajok között, ezért a Drosophila sejtes immunitásának megismerése alapvetően új elemekkel gazdagítja az élővilág védekező folyamatairól szerzett ismereteinket.

A Drosophila embrióban a feji mezodermából származó falósejtek, az ún. embrionális makrofágok már az embrionális élet korai stádiumában megjelennek. Később, a peterakást követően tizennégy-tizenhat órával, a laterális mezodermából alakul ki a fő nyirokszerv, a nyirokmirigy, mely a lárvában majdan a fő vérsejt-populációt alkotó plazmatociták, a lamellociták és a kristálysejtek képződési helyéül szolgál. Az embrionális élet végén, az embrióburkot elvető lárva már rendelkezik a vérképző szervvel. Testnedveiben plazmatociták és kristálysejtek keringenek, és a testüreg belső falához is vérsejtek tapadnak, ez az ún. szesszilis szövet. A lárva kétszer vedlik, mielőtt bebábozódna. A második vedlést követően, közvetlenül a bábozódást megelőzően, lamellociták figyelhetők meg a keringésben, melyeknek eredete és funkciója ebben a stádiumban nem ismert. A parazitákkal történt fertőzést követően nagyfokú lamellocita-differenciálódás figyelhető meg, eredetük azonban nem ismert, egyes feltételezések szerint a nyirokmirigyből származnak. A bábban az immunrendszer alapvető morfológiai és funkcionális átalakuláson megy keresztül. A nyirokmirigy szerkezete felbomlik, a bábban azonban megfigyelhető néhány falósejt. A kifejlett rovar testnedveiben ugyancsak megtalálhatók a vérsejtek, amelyek eredete szintén nem tisztázott, és az sem világos, hogy esetleg mely, eddig ismertetett vérsejt-populációhoz tartoznak. A Drosophilában folyó vérsejt-differenciálódás tehát egy komplex folyamat, melynek megismerése nemcsak érdekes, a rovarok immunrendszerét érintő kérdésekre adhat választ, hanem segítheti egy, a törzsfejlődés során megmaradt és a gerinces szervezetekben is igen hatékony funkcionális egység működésének a megértését.

Az embrionális makrofágok szabadon vándorolnak a fejlődő szövetek közötti virtuális résekben. Elsősorban az embrionális élet során zajló, szöveti átrendeződést kísérő sejtpusztulás termékeit falják fel és takarítják el. Az apoptotikus sejteket a Croquemort (Crq) transzmembrán fehérje (az emberi CD36 funkcionális homológja) ismeri fel. A vérsejtek újabb csoportjai, a lárva testnedveiben keringő vérsejtek a hemociták és a fő vérképző szerv az embrióban indul fejlődésnek. Ebben a stádiumban egy, a mezodermából kialakuló sejtcsomóban vérsejtek differenciálódnak, melyek egyes, a törzsfejlődés során konzervált transzkripciós faktorok expresszióját tekintve heterogenitást mutatnak. A transzkripciós faktorok a vérsejtek differenciálódásának a szabályozásában vesznek részt. Az őssejtek differenciálódását a Serpent (Srp) irányítja. Ezekből a sejtekből az embrióban két differenciálódási vonal származik. A Lozenge, egy Runx protein homológ a kristálysejtek, míg a Gcm1 és a Gcm2 (Glial cell missing) a plazmatociták differenciálódását szabályozzák. Ezzel szemben az U-shaped ("friend of GATA" faktor) a kristálysejtek differenciálódását gátolja. A Srp, a Lz és a U-shaped különböző kombinációkban egymással kölcsönhatva hajtják végre a vérsejt-differenciálódási programot.

A lamellociták differenciálódásának a szabályozása még kevésbé ismert, bár egyes eredmények arra utalnak, hogy a Toll aktivációs út egyes elemei is részt vesznek benne.

A Drosophila vérsejt-differenciálódási antigénrendszerének (CD-k) alapjai

Az embrió-lárva-báb-kifejlett rovar átmenet során a Drosophila szervezete alapvető változásokon megy keresztül. A különböző fejlődési stádiumokban különböző vérsejt-populációk differenciálódnak, és ennek megfelelően az egyes fejlődési stádiumokban más-más sejtpopuláció az uralkodó típus. A differenciálódás szabályozásának vizsgálatában alapvető fontosságú a megfelelő, egyes alpopulációkra, differenciálódási vonalakra jellemző molekuláris markerek használata (1. táblázat).

Bár az egyes, terminálisan differenciálódott sejtpopulációk morfológiai sajátságaik alapján elkülöníthetők egymástól (1. ábra), a közvetlen előalakok és az őssejtek morfológiai bélyegek alapján nem ismerhetők fel, így nem jellemezhetők.

Az immunológiai markerek - melyek nemcsak egyes vérsejt-alpopulációkat, differenciálódási vonalakat jellemeznek, hanem az egyes populációk szeparálására is lehetőséget adnak - használata már eddig is komoly sikereket hozott a gerincesek immunrendszerének megismerésében. Miután expressziójuk egy-egy adott sejttípusra jellemző, gyakran jelátviteli utak részeként is azonosíthatók. Megismerésük a veleszületett immunitás általános folyamatainak a megértését is segíti. Laboratóriumunkban a Drosophila vérsejtjeit jellemző immunológiai markereket azonosítunk és használunk a vérsejt-differenciálódás és a veleszületett immunitás folyamatainak a megértéséhez.

A markereket a laboratóriumunkban kifejlesztett monoklonális ellenanyagok segítségével azonosítottuk. A markerek cluster-analízise eredményeként azonosítottuk az egyes vérsejt alpopulációkra jellemző molekulákat, és kialakítottuk a Drosophila CD-ket, melyek, az egér- és az emberi CD-hez hasonlóan, alkalmasak a hemociták azonosítására és funkcionális jellemzésére. Az azonosított clustereket az 1. táblázatban foglaltuk össze. A lárvában bármely sejttípus a rá jellemző antigének mintázatával jellemezhető. A falósejtek és az antimikrobiális peptideket termelő sejtek a H, P antigének expressziójával és az L, C antigének hiányával, a tokképzésben részt vevő sejtek a H és az L antigének expressziójával és a P, C antigének hiányával, a kristályokat tartalmazó, a melanizációban részt vevő sejtek a H és a C antigének expressziója alapján és a P, L antigének hiányával, a vérsejt előalakok a H antigének expressziójával és a P, L, C antigének hiányával jellemezhetők (2. táblázat).

A vérsejtek antigénmintázata az egyedfejlődés során változik, azaz úgy tűnik, hogy az egyedfejlődés során a vérsejtek sajátos érési folyamaton mennek keresztül (1. ábra). Az embrionális makrofágokon egyik vérsejt antigén sem található meg, de valamennyin jelen van a Crq antigén. A lárva vérsejtjein a H antigének, valamint egymást kizáró módon a P, az L és a C antigének vannak jelen. A kifejlett egyedek vérsejtjeinek túlnyomó többségén a P antigének, egy alpopuláción a C antigének vannak jelen, továbbá valamennyi vérsejten megnyilvánul egy, kizárólag a kifejlett rovar vérsejtjeire jellemző antigén, az Ad1, ugyanakkor a lárvális vérsejtekre jellemző H2 antigén hiányzik. Ezek az eredmények és transzplantációs kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a Drosophila fejlődése során a vérsejtek az egyedfejlődés során megmaradnak, és túlélik a lárva-báb-kifejlett rovar átmenet során zajló nagyfokú szövetszétesést, azonban nem egyszerű túlélők. Az antigénmintázatban megnyilvánuló jellegzetes változások arra utalnak, hogy a sejtek a fejlődés során génexpresszió szintű változásokon mennek keresztül, ami az egyed fejlődésével összefüggő genetikai finomszabályozás alatt áll.

A vérsejtek differenciálódását és funkcióit a lárvában vizsgáltuk a legrészletesebben (2. és 4. táblázat). Megállapítottuk, hogy a plazmatociták, a lamellociták és a kristálysejtek egymástól különböző differenciálódási vonalat képeznek. Az osztódó sejtek a H+/-P-L-C-, a H+P-L-C-, a H+P+L-C- és a H+P+L-C+ populációban találhatók. A mikroorganizmusokat a H+P+L-C- sejtek kebelezik be. A paraziták és egyéb, eddig nem definiált ingerek a lamellocitákon és előalakjaikon az L antigének expresszióját indukálják. Az L1 és az L2 antigén először kis, plazmatocitaszerű sejteken jelenik meg, majd ezek az L1+,2+ sejtek nagy, lemezszerű lamellocitává differenciálódnak. Az L1,2 antigének megjelenését követő terminális differenciálódás során a sejtek nem osztódnak. A terminális differenciálódás komplex folyamata, azaz a kis kerek sejtekből a testidegen részecskéket beborítani képes nagy, lemezes sejtekké történő átalakulás az antigénmintázat változásaival is jellemezhető. A kis kerek sejteken megjelenik az L4 antigén, majd a terminálisan differenciálódott sejteken az L6 antigén. A folyamat a sejtváz átrendeződésével jár, melyben szerepet játszik a filamin (egy aktinkötő fehérje), hemocitákban az L5 antigénként definiált új, magas izoformájú változata. A lamellociták differenciálódása során az antigének szekvenciálisan jelennek meg. Regulációjuk tanulmányozására lehetőséget ad a sejtek szeparálása és ezzel komplex, genomikai és proteom szintű vizsgálata.

A lárvában a vérsejtek három fő kompartmentben találhatók: a keringésben, a központi nyirokszervben és a testüreg falát bélelő szesszilis szövetben (3. táblázat).

A kompartmentek markeranalízise érdekes eredményt hozott. A keringő sejtek túlnyomó többsége az érett plazmatocitákra, kisebbik hányada pedig a kristálysejtekre jellemző markereket hordozza. A központi nyirokszerv és a szesszilis szövet éretlen fenotípusú sejteket tartalmaz. Immunstimulációt követően ez a kép jellegzetesen megváltozik. A központi nyirokszervben, melyben - az irodalomban ismertetett feltételezések szerint - a differenciálódás és a vérsejtek fejlődése zajlik, semmilyen változást nem észleltünk, azonban a szesszilis szövet sejtjei osztódásnak indulnak, és rajtuk a P és az L differenciálódási markerek jelennek meg. Ugyanez történik a keringésben lévő sejtekkel. Mindez azt mutatja, hogy a vérsejtek differenciálódásának fő helye a szesszilis szövet és a keringés, nem pedig a központi nyirokszerv.

A markereink kifejeződését az embrióban sikeresen használt transzkripciós faktorok megjelenésével korreláltatva, megerősítve láttuk azt, hogy az eddig azonosított transzkripciós faktorok feltehetően részt vesznek a vérsejt-differenciálódás szabályozásában. A lárva vérsejtjeiben a szabályozás a faktorok egymással történő komplex kölcsönhatása révén valósul meg, ami lényegesen különbözik a faktoroknak az embrionális makrofágokban betöltött kizárólagos szabályozó szerepétől.

Mivel az antigének kizárólag vérsejteken vagy alpopulációkon találhatók, megismerésük segíthet a veleszületett immunitás működésének a megértésében. Az antigének biokémiai jellemzése és a gének molekuláris szintű jellemzése már eddig is sok érdekes információval szolgált. A H2 antigén (Hemese) a lamellociták differenciálódását szabályozó transzmembrán fehérje, mely a glikoforinok családjának egy új tagja. Anti-adhéziós molekula, mely a sejtek érése során feltehetően a szesszilis szövetből történő távozásukat biztosítja. A P1 antigén egy EGF (epidermális növekedési faktor) receptor doméneket hordozó transzmembrán fehérje, melynek közvetlen környezetében tíz, vele nagyfokú szerkezeti homológiát mutató gént - terminológiánk szerint a P1-géncsaládot - azonosítottunk. Meglepő lenne, ha ez a géncsalád nem játszana alapvető szerepet a vérsejt-differenciálódás szabályozásában. Az L1 antigénnel kapcsolatos adataink arra utalnak, hogy ez egy GPI-kapcsolt (glikofoszfatidilinozitol) membránfehérje, melynek több szerkezeti homológja található az élővilágban, köztük gerincesekben. Legközelebbi eddig azonosított gerinces homológja a leukocitákban történő jelátviteli folyamatokat szabályozza. A fehérje biokémiai jellemzése azt mutatja, hogy membrán hajókban-lipidtutajokban helyezkedik el, és nagyobb, jelátviteli komplexek létrehozásában játszik aktív szerepet.

A Drosophila CD antigének a gerincesekben azonosított funkcionális homológok megismerésén túlmenően nemcsak az antigének in vivo vizsgálatát teszik lehetővé, hanem a vérsejt-differenciálódás komplex genomikai elemzését is. A gének regulátor régióinak izolálása és genetikai rendszerekben történő felhasználása elősegíti a veleszületett immunitásban részt vevő jelátviteli utak térképezését. A regulátor régiók segítségével szövet- és sejttípus-specifikusan megnyilvánuló markermolekulák az immunválasz nyomon követését teszik lehetővé in vivo. Eddig a H2 antigén regulátor régióját izoláltuk, és segítségével funkciónyeréses genetikai screent végeztünk. Megállapítottuk, hogy a vérsejtek proliferációja és terminális differenciálódása egymástól elválasztható genetikai szabályozás alatt állnak, azaz különböző jelátviteli utak szabályozzák. A screenben azonosított komponensek komplex genomikai jellemzése és az aktivációs utak térképezése folyamatban van.

Az L1-L6 antigének megjelenésével jellemzett lamellocita-differenciálódás, a H2-Ad1 váltás genomikai szintű vizsgálata, az L1 antigénnel asszociált fehérjék analízise és a regulátor régiók izolálását követően létrehozott genetikai meghajtóelemek alkalmazása minden bizonnyal további új ismeretekkel gyarapítja a vérsejtek differenciálódásáról szerzett eddigi ismereteinket.

Fontos megjegyezni, hogy minden gerinces szervezet rendelkezik veleszületett immunitással, melynek elemei részt vesznek a szerzett immunitás (az ellenanyag-termelés és a T sejt-válasz) kialakulásában és az effektor folyamatok irányának a megszabásában. Az elmúlt évszázadban a figyelem elsősorban a szerzett immunitás megismerésére összpontosult, és csak a századforduló környékén kezdődött el a veleszületett immunitás folyamatának a részletesebb vizsgálata. Az érdeklődés először a nagytestű ízeltlábúak (Cecropia, Manduca) felé fordult, de a Drosophila genetikai rendszerének megismerése, majd genomjának szekvenálása és a kódoló régiók meghatározása ezt a fajt helyezte a kísérletek középpontjába. A molekuláris genetika eszköztára a Drosophila genom megismerésével kombinálva egyedi lehetőségeket kínál; nemcsak in vitro, hanem in vivo körülmények között is lehetővé válik a veleszületett immunitás komplex genetikai, genomikai analízise.

Köszönetnyilvánítás: Az ismertetett, de még közöletlen eredmények az OTKA (T035074 és T035249) és a Szegedi Biológiai Központ által adományozott Center of Excellence, Contract Number: ICA 1-CT-2000-70026 támogatások segítségével születtek.


Kulcsszavak: veleszületett immunitás, Drosophila, genetikai szabályozás, sejtfelszíni antigén, receptor, differenciálódási marker, hemocita



	CD	Sejttípus	 			M.S.+		Klón

	H1	minden vérsejt és embrionális makrofág 	135-160		H11
	H2	minden keringő vérsejt			30-60		1.2
	H3	minden keringő vérsejt			16		4A12

	P1a	plazmatocita				100-110		N1
	P1b	plazmatocita				100-110		N47
	P3	plazmatocita alpopuláció 		*		8B1

	L1a	lamellocita				16		H10
	L1b	lamellocita				16		7A6
	L1c	lamellocita				16		29D4		
	L2	lamellocita				44		31A4
	L4	lamellocita alpopuláció			82-86		1F12
	L5	lamellocita alpopuláció			85-100,240	4B8
	L6	lamellocita alpopuláció           	96		H3


	C1	kristálysejtek és előalakjaik		84		12F6
	C2	kristálysejtek és előalakjaik		*		21D3
	C3	kristálysejtek és előalakjaik		*		10D2 
	C4	érett kristálysejtek			100		9C8
	C5	érett kristálysejtek			66,135		1.19

	Ad1	felnőtt vérsejtjei			10		7C8		

		+  kDa, nem redukált körülmények között

		* térszerkezetfüggő epitóp

1. táblázat * Drosophila vérsejt-antigének (CD-k)


1. ábra * A morfológiai jegyek alapján felismerhető vérsejttípusok Drosophilában



Cluster    	Őssejtek 	Fagocitáló sejtek  	Lamellociták   	 Kristálysejtek

H2		+/-		+			+		+

P1		-		+			-		-

L1-L6		-		-			+		-

C1		-		-			-		+

2. táblázat * A Drosophila vérsejtjeinek fenotípusa

CD Központi nyirokszerv Szesszilis szövet Keringő vérsejtek H2 + +/- + P1 -1 +/- +2 L1-L6 -1 - -3 C1 - - + 1 Indukciót követően jelenik meg 2 Első lárvastádiumban jelenik meg és a 3. stádiumig heterogenitást mutat. 3 Késői harmadik stádiumban és immunindukciót követően jelenik meg.

2. táblázat * A Drosophila lárva vérsejt-kompartmentjeinek immunológiai fenotípusa



H2+/-L1-P1-C1- (őssejtek)		Fagocitózis, sejtosztódás

H2+L1-P1+C1- (Fagocitáló sejtek 	Fagocitózis, cecropintermelés	és 
közvetlen előalakjaik)			és sejtosztódás 	

H2+L1+P1-C1- (Lamellociták 		Tokképzés, cecropintermelés 
és közvetlen előalakjaik)		és fagocitózis hiánya, 			
					sejtosztódás hiánya 

H2+L1-P1-C1+ (Kristálysejtek)		Melanizáció, koaguláció

4. táblázat * A vérsejt-alpopulációk funkciói


2. ábra * A vérsejtek fenotípusának vátozásai az egyedfejlődés során


Irodalom

Evans, Cory J. - Hartenstein, Volker - Banerjee, Utpal (2003): Thicker Than Blood: Conserved Mechanisms in Drosophila and Vertebrate Hematopoiesis. Developmental Cell. 5, 5, 673-690

Leclerc, Vincent - Reichhart, Jean-Mark (2004): The Immune Response of Drosophila Melanogaster. Immunological Reviews, 198, 1, 59-71

Werner, Thomas - Borge-Renberg, K. - Mellroth, P. - Steiner, H. - Hultmark, D. (2003): Functional Diversity of the Drosophila PGRP-LC Gene Cluster in the Response to Lipoplysaccharide and Peptidoglycan. Journal of Biological Chemistry. 278, 29, 26319-26322

Kimbrell, Deborah A. - Beutler, Bruce (2001): The Evolution and Genetics of Innate Immunity. Nature Reviews, Genetics. 2, 2, 256-267

Hultmark, Dan (1994): Insect Immunology. Ancient Relationships. Nature. 367, 116-117

Hedengren, Marika - Åsling, B. - Dushay, M. S. - Ando I. - Ekengren, S. - Wihlborg M. - Hultmark, D. (1999): Relish, a Central Factor in the Control of Humoral, but not Cellular Immunity in Drosophila. Molecular Cell. 4, 827-837

Kurucz Eva - Zettervall, C.-J. - Sinka R. - Vilmos, P. - Pivarcsi A. - Ekengren, S. - Hegedüs Z. - Ando I. - Hultmark, D. (2003): Hemese, a Hemocyte-specific Transmembrane Protein, Affects the Cellular Immune Response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100, 2622-2627

Vilmos Péter - Nagy I. - Kurucz É. - Hultmark, D. - Gateff, E. - Ando I. (2004): A Rapid Rosetting Method for Separation of Hemocyte Sub-populations of Drosophila Melanogaster. Developmental and Comparative Immunology, 28, 555-563